Иммуноферментный анализ (отбор, хранение и подготовка проб).

В. Г. Осипова, врач ветеринарной медицины,

заведующая лабораторией ВЦ «Алден-Вет»

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. ELISA – Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) – это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения различных химических соединений, биологических объектов (вирусов, бактерий, простейших и пр.), а также иммуноглобулинов, гормонов и других макромолекул. В основе метода лежит принцип взаимодействия иммуносорбента-антигена (например, возбудителя определенной инфекции) с выявляемыми антителами. Поскольку антитела высокоспецефичны к соответствующим антигенам, то в зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала

Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время составляет более 90%.

Тест-системы для иммуноферментной диагностики выявляют широкий круг различных инфекций: герпесной, токсоплазменной, хламидийной, микоплазменной и др.

ИФА дает возможность определения антител (IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются иммунной системой в ответ на присутствие возбудителя (антигена) в организме.

Благодаря тому, что иммуноглобулины разных классов вырабатываются в определенной последовательности, с помощью ИФА можно диагностировать инфекцию на разных стадиях, и отслеживать динамику развития процесса.

Также ИФА широко применяется для диагностики патологий эндокринной системы.

Материалом для исследования служит сыворотка или плазма венозной крови, взятой натощак.

Условия взятия крови и ее хранение до начала лабораторных исследований имеют важное значение для получения достоверных результатов. Во многом эти результаты зависят от техники взятия крови и используемых при этом инструментов. При заборе крови для анализа прокол окружающих вену тканей и стенки сосуда делают в один прием. Иглы для взятия крови должны быть с коротким срезом и достаточно большим диаметром, чтобы не травмировать противоположную стенку вены и не вызвать повреждения эритроцитов. Кровь должна стекать по стенке пробирки, чтобы избежать разрушения эритроцитов.

В зависимости от характера исследований готовят определенное количество пробирок. Стенки стеклянной посуды способны обмениваться ионами с кровью, а следы моющих средств и поврежденные пробирки влияют на активность гормонов, ферментов. Это можно исключить, если применять пластиковые пробирки одноразового использования. В зависимости от задач исследования анализу подвергают цельную кровь, плазму или сыворотку.

Для получения сыворотки, пробирки с кровью рекомендуется в процессе взятия крови помещать в термостат с температурой до 38°С. Цельную кровь, плазму и сыворотку для непродолжительного хранения помещают в холодильник (+2-+4°С), длительное хранение сыворотки требует замораживания и хранения при температуре –20°С.

Нарушение условий хранения проб может стать причиной погрешностей анализа. В результате длительного стояния сыворотки, над эритроцитами могут наступить сдвиги в концентрации ряда компонентов. Неумелое встряхивание проб при перемешивании их содержимого или при транспортировке также может вызвать гемолиз эритроцитов.

Ошибки, возникающие на внелабораторном этапе анализа, составляют, в среднем, от 70% до 95% всех погрешностей, которые допускаются при проведении анализа. Именно они могут оказаться непоправимыми и полностью обесценить весь ход проводимых исследований и их результаты.

При получении, обработке и доставке образцов в лабораторию следует иметь в виду следующие факторы, которые могут быть как устранимыми, так и неустранимыми.

Циркадные ритмы изменения концентрации гормонов у исследуемого животного, наиболее ярко выражены для кортизола, адренокортикотропного гормона (АКТГ), альдостерона, пролактина, соматотропного гормона (СТГ), ренина, тиреотропного гормона (ТТГ), паратгормона, тестостерона. Отклонения концентраций от среднесуточных значений могут достигать 50%-400% и этот фактор обязательно должен приниматься во внимание. Например, суточное колебание (циркадный ритм) уровня кортизола может являться причиной недостоверных результатов теста на толерантность к глюкозе, если он проводится во второй половине дня.

Для того чтобы не затруднять процесс интерпретации результатов, отбор проб для анализа нужно проводить строго в определенное время суток, обычно между 9 и 11 часами утра.

При проведении специальных исследований, например, при установлении индивидуального циркадного ритма секреции гормона, в течение суток отбирается несколько проб анализируемого материала. В документах, сопровождающих такие образцы, необходимо указать точное время взятия каждого из них.

В некоторых случаях следует учитывать сезонные влияния. Например, содержание трийодтиронина (T3) в сыворотке (плазме) крови на 20% ниже летом, чем зимой.

Физические и стрессовые нагрузки оказывают значительное влияние на содержание таких гормонов, как кортизол, тестостерон, АКТГ, ангиотензин, альдостерон, ренин, пролактин, СТГ, ТСГ, миоглобин, катехоламины, вазопрессин и др.

При анализе гормонов, концентрация которых может быстро изменяться в течение суток, например, тестостерона, рекомендуется использовать смешанную пробу, полученную из трех образцов сыворотки (плазмы) крови, отобранных с интервалом в несколько часов.

Диагностические и лечебные процедуры, такие как оперативное вмешательство, внутривенные вливания, пункции, биопсии, функциональные тесты часто оказывают влияние на результаты лабораторных исследований. Для исключения этих факторов отбор образцов крови рекомендуется проводить до выполнения любых лечебных и диагностических процедур.

Прием лекарственных препаратов может отражаться на количественном содержании в организме целого ряда анализируемых показателей. Например, уровень ТТГ снижается при лечении допамином, концентрация общих и свободных фракций тиреоидных гормонов (Т3, Т4) изменяется при введении фуросемида, даназола, амиодарона и салицилатов, а применение некоторых противоязвенных препаратов может повышать уровень пролактина.

Присутствие лекарственных препаратов в биологическом материале, например, салицилатов, андрогенов и др., может специфически (перекрестная реакция) или неспецифически влиять на результаты лабораторных исследований при определении концентрации стероидных и тиреоидных гормонов, а также специфических связывающих белков крови. Поэтому проведение медикаментозной терапии, могущей искажать результаты анализа, следует назначать после взятия проб крови.

Повторные взятия проб крови широко используются в динамических исследованиях, например, при проведении стимуляционных тестов, для оценки эффективности проводимого лечения, при прогнозировании исхода заболевания, при лекарственном мониторинге, а также в целом ряде других случаев.

Этот же принцип используется при диагностике и лечении инфекционных заболеваний – выявление специфических антител к возбудителю и динамика их уровней в ходе лечения.

Гемолиз и липемия проб являются факторами риска, способными снижать достоверность результатов анализа. Это связано с тем, что в клетках крови содержится в высокой концентрации целый ряд компонентов, определяемых в сыворотке или плазме. При гемолизе они могут высвобождаться в анализируемую пробу и изменять ее состав, затрудняя интерпретацию результатов исследования.

Мутные образцы с повышенным содержанием липопротеинов и триглицеридов не рекомендуется использовать в качестве анализируемого материала.

Из специальных рекомендаций следует отметить, что при заборе крови для определения АКТГ рекомендуется использовать пробирки из полистирола, поскольку стекло адсорбирует этот гормон.

Правильная и четкая маркировка пробирок является очень важным моментом, так как позволяет исключить путаницу при идентификации животных, запросов на пробы, самих проб и результатов исследований.

Подготовленный и промаркированный биологический материал должен быть, как можно быстрее доставлен в лабораторию. Следует иметь в виду, что упущения при транспортировке, нарушающие сохранность проб, делают невозможным правильное определение искомого объекта в пробе.

Для пересылки проб следует использовать герметически закрывающиеся пробирки из инертного небьющегося материала. Пробирки должны быть помещены в специальный контейнер с абсорбентом, который снижает риск протекания при каком-либо механическом повреждении и обеспечивает необходимые меры безопасности. При транспортировке охлажденных или замороженных образцов рекомендуется использовать теплоизолирующий контейнер из пенопласта, в который можно поместить сухой лед или охлаждающие элементы. Существенным требованием является надежная упаковка проб, с тем, чтобы обеспечить их сохранность в процессе доставки.

Добавить комментарий